賴秋明團隊：EMS發病特點及防控

　　南美白對蝦“早期死亡綜合癥”的發病特點及防控
　　
　　蘇樹葉 賴秋明 陳金玲 柯楊勇
　　
　　海南大學，海南�？�，570228

　　
　　中國水產頻道獨家報道，自2009年以來，南美白對蝦“早期死亡綜合癥”（EarlyMortalitySyndrome）在亞洲地區爆發并蔓延，給亞洲各國的對蝦養殖業帶來了巨大的經濟損失。最近也有學者將該病稱為“急性肝胰臟壞死綜合癥”（AcuteHepatopancreasNecrosisSyndrome）。有關南美白對蝦“早期死亡綜合癥”的研究已有報道，如FlegelT.W.、LightnerD.、EduardoM.Leano等曾報道南美白對蝦“早期死亡綜合癥”的主要發病癥狀和致病的可能性因素，但對于該病的原發性病原和病因至今尚未有確切的定論。
　　
　　1南美白對蝦“早期死亡綜合癥”的發病特點
　　
　　2010～2012年期間，筆者在海南調研了大量發生“早期死亡綜合癥”的蝦塘并走訪了眾多的養殖戶，通過現場的觀察、采樣檢測及與養殖技術人員的交流，發現不同地區和不同季節發生的“早期死亡綜合癥”都有許多相同的發病特點。并采集了放養30天左右攝食生長正常的和患“早期死亡綜合癥”的南美白對蝦活體樣品。正常組對蝦采自海南省文昌市林梧養殖場的6口池塘，患病組對蝦采自海南省澄邁縣的馬村養殖場和南港養殖場的6口池塘。對蝦樣品通過無菌操作和低溫保存，帶回實驗室分別進行肝胰臟和中腸組織切片、肝胰臟的弧菌和可培養細菌的檢測，并采用PCR（聚合酶鏈式反應）方法檢測白斑綜合癥病毒（WSSV）、桃拉綜合癥病毒（TSV）和皮下及造血器官壞死病毒（IHHNV）三種特定病毒�，F將“早期死亡綜合癥”的發病特點和相關的實驗結果歸納整理如下，旨在為南美白對蝦“早期死亡綜合癥”的防治及流行病學的研究提供參考。
　　
　　1.1對蝦“早期死亡綜合癥”的主要外觀癥狀
　　
　　蝦苗放養10-30天為該病的高發期，患病對蝦體色呈白濁并微紅，多數情況下肝胰臟異常腫大，質地松軟，顏色呈淡白或淡黃色；部分患病對蝦的肝胰臟明顯萎縮，質地變硬（圖1）。發病期間，患病對蝦通常在池塘水面緩慢游動或趴伏于池塘邊坡上，失去食欲，胃、腸充塞度極差，嚴重者胃腸呈紅色。該病病情發展十分迅速，死亡率和排塘率極高，從發現少量病蝦到排塘，時間最短的僅2-3天�；疾�對蝦樣品經PCR方法檢測，通常未被檢出攜帶WSSV、TSV、IHHNV等特定病毒，但肝胰臟和腸組織勻漿經TCBS培養基的培養，均被檢測出有大量的弧菌。對蝦的發病通常與蝦池藻類的老化死亡有密切關系，檢測池水的弧菌數量較大，且往往是綠色弧菌占絕對優勢。美國亞歷桑那大學的Lightner教授在2012年8月的曼谷研討會上指出，到目前為止，從越南和中國采集的患病對蝦樣本的組織濾液在人工感染試驗中無法證實該病是由病毒引起的，病蝦樣品的PCR測試結果顯示，“早期死亡綜合癥”與白斑綜合癥病毒、黃頭病毒、傳染性肌肉壞死病毒和桃拉綜合癥病毒沒有直接的關系。2013年3月，拜耳（四川）動物保健有限公司的劉濤博士應Chalor教授的邀請前往泰國農業大學參觀訪問，據Chalor教授介紹，他們的實驗中心在一年多前就嘗試用病蝦作為實驗材料開展人工感染試驗，甚至用病蝦的肝胰臟勻漿濾液注射到健康的對蝦，其結果也不能導致健康對蝦的發病，認同“早期死亡綜合癥”不是由病毒引起的觀點。
　　

　　
　　圖1示患病對蝦肝胰臟的腫大和萎縮
　　
　　1.2對蝦肝胰臟和中腸的組織學觀察
　　
　　通過顯微鏡觀察，發現正常對蝦和患病對蝦肝胰臟和中腸的組織形態有很大的差異。正常對蝦的肝胰臟為復管狀腺，由多級分支的肝小管組成，肝小管管壁由單層細胞構成，管腔呈五角或四角星形，腺細胞正常（圖2）；中腸管壁組織厚度均勻、致密，腸腔中充滿內含物（圖4）�；疾�對蝦肝胰臟的腺細胞間隙變大，腺細胞核變小，腺細胞有不同程度的自溶現象，肝小管變形（圖3）；中腸腸壁變薄，腸粘膜脫落并散落于腸腔內，腸腔中沒有內含物（圖5）。
　　

　　
　　圖2正常南美白對蝦的肝小管橫切面

　　圖3患病南美白對蝦的肝小管橫切面
　　

　　
　　圖4正常南美白對蝦的中腸橫切面圖

　　5患病南美白對蝦的中腸橫切面
　　
　　1.3對蝦肝胰臟弧菌和可培養細菌的數量
　　
　　通過對生長正常和患病對蝦的活體樣品體內細菌的檢測，發現兩者的肝胰臟和腸道均有大量的細菌，但兩者細菌的數量和種類有顯著的差異。正常組對蝦肝胰臟的可培養細菌密度范圍為1.59×10⁶～5.83×10⁶cfu·g^-1，平均3.18×10⁶cfu·g^-1；弧菌密度為1.46×10⁵～2.99×10⁵cfu·g^-1，平均1.97×10⁵cfu·g^-1，占可培養細菌的7.64%；在TCBS培養平板上觀察，黃色弧菌占絕對優勢，密度范圍為1.20×10⁵～2.86×10⁵cfu·g^-1；綠色弧菌的密度范圍為0.6×10⁴～3.9×10⁴cfu·g^-1，黃色弧菌的密度是綠色弧菌密度的10.25倍，其中的一株黃色弧菌為絕對優勢菌株。

　　
　　患病對蝦肝胰臟的可培養細菌密度為2.87×10⁶～8.24×10⁷cfu·g^-1，平均2.71×10⁷ cfu·g^-1；弧菌密度為1.28×10⁶～3.59×10⁶cfu·g^-1，平均1.87×10⁶cfu·g^-1，是正常對蝦組的9.5倍，弧菌占可培養細菌的15.89%；在TCBS培養平板上觀察，綠色弧菌占絕對優勢，密度范圍為1.02×10⁶～2.97×10⁶cfu·g^-1，平均1.42×10⁶cfu·g^-1，黃色弧菌的密度為0.2×10⁶～0.63×10⁶cfu·g^-1，綠色弧菌密度是黃色弧菌密度的3.16倍，其中的一株綠色弧菌為絕對優勢菌株。

　　
　　兩株優勢菌株均為革蘭氏陰性菌，菌體為彎桿狀，無芽孢，對弧菌抑制劑O/129均敏感，發酵葡萄糖產酸不產氣，生長需NaCl，可利用D-甘露醇，在TCBS平板上分別形成黃色和綠色的圓形菌落，具有弧菌屬的典型特征。
　　
　　今年3月，Chalor教授向拜耳（四川）動物保健有限公司的劉濤博士介紹，他們在泰國和其它地區也發現病蝦的肝胰臟內有大量的細菌存在。他還向記者透露，Lightner教授最近發現了一些有趣的現象，在越南的一些區域，他們在“早期死亡綜合癥”病蝦體內分離出一些細菌，目前還在研究試驗當中，看是否就是這些細菌導致對蝦的“早期死亡綜合癥”。
　　
　　1.4兩株弧菌優勢菌株對南美白對蝦的人工感染
　　
　　我們從患病對蝦的肝胰臟分離出一株弧菌優勢菌株，在TCBS培養基上其菌斑的顏色呈綠色；正常對蝦的弧菌優勢菌株則是一株黃色弧菌，在TCBS培養基上其菌斑的顏色呈黃色。在實驗室條件下，分別用兩株弧菌優勢菌株以不同的密度梯度接種到水族箱對健康的南美白對蝦幼蝦進行人工感染試驗。實驗結果表明：沒有接種任何菌株的對照組的對蝦攝食生長正常，實驗結束時，水體和對蝦肝胰臟內均檢出少量的黃色弧菌，但未檢出綠色弧菌；在接種綠色弧菌的試驗組中，只要水中綠色弧菌的接種密度達到0.5×10⁴cfu·mL^-1時，水族箱的對蝦從接種的第3天開始出現死亡，10天內的累計死亡率達到72%；當接種密度為2.5×10⁴cfu·mL^-1時，10天內的累計死亡率達到98%。死亡對蝦的外表癥狀與“早期死亡綜合癥”基本一致，出現肝胰臟腫大、顏色淡黃、失去食欲、空腸空胃等典型癥狀，并從死亡幼蝦的肝胰臟檢測到大量的綠色弧菌和少量的黃色弧菌；在接種黃色弧菌的試驗組中，試驗期間幼蝦攝食生長基本正常，僅有少量幼蝦死亡，10天內的累計死亡率為15.5%～22%，死亡幼蝦沒有“早期死亡綜合癥”的典型癥狀，實驗結束時，在養殖水體和幼蝦的肝胰臟中均檢出大量的黃色弧菌，但未檢出綠色弧菌。實驗結果表明，兩株弧菌優勢菌株在養殖水體中均可經口感染對蝦的消化器官，有很強的感染能力，并可在對蝦的消化器官中定植并生長繁殖。通過比較兩組對蝦的累計死亡率，筆者認為綠色弧菌比黃色弧菌具有更強的毒力。本次人工感染試驗是在實驗室的條件下進行，由于受光照的限制，養殖水體中沒有藻類，說明在沒有藻類存在情況下，對蝦同樣會出現“早期死亡綜合癥”的癥狀；本次實驗設置的綠色弧菌最小接種密度為5.0×10³cfu·mL^-1，10天內幼蝦的累計死亡率達到72%，綠色弧菌在南美白對蝦養殖水體中的安全密度應少于5.0×103cfu•mL-1。
　　
　　2“早期死亡綜合癥”的防控措施
　　
　　南美白對蝦“早期死亡綜合癥”的發生除了與大量的弧菌感染有密切關系之外，也和養殖生態環境差、藻毒素的影響以及對蝦自身體質虛弱等諸多因素有關。因此，該病的防控是一項綜合系統工程，應同時從改善養殖環境、控制和消除病原和提高對蝦自身免疫功能等多方面著手才能收到較理想的效果。經過兩年來的生產實踐證明，只要方法對頭，措施得力，對蝦“早期死亡綜合癥”仍然是可防可控的，許多成功的養殖案例已證實了這一點。
　　
　　2.1定期檢測養殖水體中的弧菌密度
　　
　　綜合分析其發病的特點，筆者認為“早期死亡綜合癥”是對蝦一種細菌性的消化系統疾病，綠色弧菌的大量感染導致對蝦消化道的菌群失衡，危害和損傷對蝦的消化器官，使對蝦失去食欲并最終導致對蝦的大量死亡。在以往發生“早期死亡綜合癥”的蝦池中，養殖水體中通常被檢測出有大量的綠色弧菌。建議在蝦苗放養前要檢查水中弧菌的密度，若水中綠色弧菌密度超過3.0×10² cfu·mL^-1或總弧菌密度超過5.0×10³ cfu·mL^-1，應進行水體消毒和適量施用有益微生物后再放苗；養殖期間每5～7天檢測一次，若發現水中弧菌超標，應及時進行水體消毒，24小時后再適量施用有益微生物。
　　
　　2.2培養和維持良好的水色
　　
　　池塘水色是水中單細胞藻類密度和種類組成的綜合表現。藻類的光合作用可增加水中的溶解氧，吸收水中無機氮、磷和二氧化碳，對改善水質和促進池塘物質循環起著至關重要的作用。因為以往發生“早期死亡綜合癥”的池塘通常與“倒藻”有密切關系，所以許多養殖戶忽略培藻環節，采取清水放苗，筆者認為這是一種不可取的做法。放苗前的培藻施肥應遵循少量多次的原則，透明度以30～50厘米為宜，水色以黃綠色為佳。養殖期間若發現水色色澤變暗、池水泡沫增多且表層漂浮少量死藻的現象時，說明藻類開始老化，應及時適量的換水，以維持藻類的正常生長，避免“倒藻”現象的發生。
　　
　　2.3維持池塘微生物的多樣性和數量的相對穩定
　　
　　在對蝦養殖的池塘生態系統中，微生物是不可缺少的生物類群，它們在池塘的物質循環、能量傳遞和水體凈化等方面發揮著極其重要的作用。通常情況下，養殖水體的微生物以好氧微生物為主，它們可以分解和利用水中的有機物，凈化水質和底質。在對蝦養殖的日常生產管理中，若強力增氧和保持有機碎屑在水中呈懸浮狀態，不僅可促進好氧微生物的生長繁殖，強化養殖水體的自凈功能，而且可限制其它兼性厭氧微生物的生長繁殖。許多弧菌屬的細菌是條件性致病菌，多屬于兼性厭氧型微生物，當其在水中密度較大和對蝦體質較弱時，容易感染對蝦并造成危害。因此，在對蝦養殖過程應定期檢測池水中的總細菌密度，養殖早期總細菌密度以3.0×10⁴～5.0×10⁴ cfu·mL^-1較為適宜；養殖中、后期隨著水中懸浮有機物的增加，總細菌密度會相應增大，以1.0×10⁵～2.0×10⁵ cfu·mL^-1較為理想。許多的成功養殖實例證明，當水中總細菌密度較大時，池塘水質通常比較穩定，對蝦的攝食生長也較為正常。另外，保持池塘微生物的物種多樣性也極為重要，種類組成越復雜，更利維持總細菌數量的穩定；若微生物的種類過于單一，天氣或其它環境因子的突然變化均可能會導致池塘微生物數量的大幅下降。在養殖生產中，許多養殖業者通常采取多種有益微生物制劑的混合使用或交替使用，這對保持池塘微生物的物種多樣性和數量的穩定有很好的作用和效果。近年一些養殖業者喜歡采用“老水”養蝦，并獲得較好的養殖效果。所謂“老水”養蝦就是將上一茬養蝦效果最佳和水質最為穩定的一池水留下來，等到其它池塘進水準備放養下一茬蝦時，再將這池“老水”分別抽到每一口蝦池，相當于給每口準備放苗的池塘接入菌種和藻種�！袄纤�”中微生物的種類組成穩定且比較理想，對當地的環境條件具有較強的適應能力，筆者認為這是一種可取的做法。
　　
　　2.4實行科學的投喂管理
　　
　　科學的投喂管理的宗旨是盡量避免飼料的過量投喂。目前許多養殖戶擔心對蝦吃不飽而影響其生長速度，只要看見餌料觀察網里沒有飼料就在下一餐次加料，而且每一天加料的幅度很大，希望對蝦長得更快一些，其實這種做法的結果往往是事與愿違。南美白對蝦有貪吃的習性，雖然飼料吃完了，也被消化了，但營養物質并沒有完全被對蝦所吸收利用，很多的營養物質被當作代謝產物而排到水里，不僅造成飼料的浪費，污染了水質，而且還會加重對蝦消化系統的負擔，長期如此勢必會導致對蝦消化器官的功能紊亂。其實這種現象早在2000年海南剛開始養殖南美白對蝦的時候就發生過，很多對蝦養了20天左右，攝食量開始迅速增加，但經過連續幾天的大幅度加料后，對蝦的消化系統就開始出現問題，隨后池蝦的食欲就大幅下降并發病死亡。今年3月，泰國農業大學Chalor教授向拜耳動物保健有限公司的劉濤博士介紹，目前泰國也有類似的情況發生，如果管理方面過于激進，比如放養密度越高，投料越多，就越容易發生“早期死亡綜合癥”疫情。因此，在確定飼料投喂量時，既要參照餌料觀察網的飼料攝食情況，同時還要結合不同生長階段對蝦的現存量、個體規格和相應的日投餌率來計算理論投餌量，以此來修正經驗投餌量，盡量避免飼料的過量投喂。
　　
　　2.5優化對蝦消化道的菌群組成
　　
　　乳酸菌屬于非致病菌，是一類兼性厭氧微生物，它們產生的酸性物質和代謝產物不僅能強化對蝦的消化吸收功能，增強食欲和促進生長，而且可抑制對蝦消化道弧菌的生長繁殖。最近我們從一些養殖效果較佳、對蝦生長情況較好的池塘采集了許多活體對蝦樣品，發現正常對蝦的消化道有大量的乳酸菌存在，其中某些乳酸菌是對蝦消化道的優勢菌株，可占到消化道總細菌數量的40%。在實驗室的弧菌平板培養中，發現這些乳酸菌對綠色弧菌和黃色弧菌都有顯著的抑制效果，抑菌圈的大小可與許多抗菌素相媲美。在對蝦養殖過程中不定期地使用乳酸菌拌料投喂對蝦，將有助于優化對蝦消化道的菌群組成，對增強對蝦食欲和預防消化道疾病均有很好的效果。